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2014-11-11DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白

药品试剂
1、DEAE纤维素DE-23 1.5g
2、0.5mol/L NaOH 100ml
3、0.5mol/L HCl 50ml
4、0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液250ml
5、0.02mol/L pH7.3(含0.2mol/L NaCl)的Tris-HCI缓冲液50ml
实验步骤
1、离子交换剂的处理:称取1.5gDFAE纤维素(DE-23)干粉,加入0.5mol/L NaOH溶液(约50ml),轻轻搅拌,浸泡至少0.5小时(不超过1小时),用玻璃沙漏斗过滤,并用去离子水洗至近中性,抽干后,放入小烧杯中,加50ml的0.5mol/L HCl,搅匀,浸泡0.5小时,用去离子水洗至近中性,再用0.5mol/L NaOH重复处理一次,用去离子水洗至近中性后,抽干备用(因DEAE纤维素昂贵,用后务必回收)。实际操作时,通常纤维素是以浸泡过并回收的,按“碱-酸”的顺序洗即可,因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难,可以先浮选除去细颗粒,抽干后用0.5mol/L NaOH 0.5mol/L NaCl溶液处理,然后水洗至中性。
2、装柱与平衡:先将层析柱垂直装好,在烧杯内用0.02mol/L pH7.3 Tris-HCI缓冲液洗纤维素几次,用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱,然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。
3、上样与洗脱:上样前先准备好梯度洗脱液。采用20ml 的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCI缓冲液和20ml含0.2mol/L浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCI缓冲液,进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml烧杯,一个装20ml含NaCl的高离子强度溶液,两一个装入20ml低离子强度溶液,放在磁力搅拌器上,在低离子强度溶液的烧杯内让入一个小搅拌子(在细塑料管内放入一小段铁丝,两端用酒精灯加热封口),将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中,上端接一段乳胶管,夹上止水夹,用吸耳球小心地将溶液吸入三通,立即夹紧乳胶管,使两个烧杯溶液形成连通,注意两个烧杯要放妥善,切勿使一杯高,一杯低。
样品小心地加到层析柱上,不要扰动柱床,注意要从上样开始时使用部分收集器收集,控制流速每10分钟2.5-3ml。上样后用缓冲液洗两次,然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质,至A280降到0.1以下,夹住层析柱出口,将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中,用胶布固定塑料管,加好层析柱,打开磁力搅拌器,放开层析柱出口,开始梯度洗脱,连续收集洗脱液,两个小烧杯中的洗脱液用尽后,为洗脱充分,也可将所配置的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱,控制流速每10分钟2.5-3ml。测定每管洗脱液的A280光吸收值。
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