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2016-09-08ELISA实验操作要点:样本的收集及保存操作不当会影响ELISA实验结果

ELISA(酶联免疫试验)以其灵敏度较高、特异性好的特点已广泛用于科研实验及临床,越来越多科研单位选择用ELISA实验方法完成研究课题。优质的试剂、好的仪器和正确的操作是保证ELISA试剂盒检测结果准确可靠的必要条件,但样本的收集及保存操作不当也会影响ELISA实验结果。样本的收集跟保存听上去貌似很简单,但不乏有许多科研工作者因为样本的收集跟保存没做好而影响实验结果。

下面针对样本收集及保存江莱生物提几点建议:
1.严重溶血,以HRP为标记的ELISA测定中,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性,催化底物显色造成假阳性;
2.混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净;如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应:
3.标本凝固不全,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;
4.采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染:塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

血清标本宜在新鲜时检测,严重溶血标本禁用。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存;使用一次性玻璃试管或真空管采血管;并使用非抗凝标本,肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性;血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

被检血清或血浆标本,可用含保护性封阻剂(吐温-20)或称湿润剂的缓冲液来稀释。也可加入一些蛋白质,如1%牛血清白蛋白等来稀释。然后再加到已经用抗原或抗体包被的固相载体中进行孵育。此种被试标本可作一系列稀释度测定,也可用一个稀释度测定。对于作某一个传染病的诊断来说,最好先用一系列稀释度作一批标本测定,求出对诊断有意义的一个稀释度(即测定剂量反应曲线),然后用一个稀释测定即可。最适稀释度和孵育时间均需从实践中摸索出来,对一般病原微生物所引起的传染病的血清学诊断,以1:200稀释度测定比较适当,而试验标本的(即含抗体)作用时间一般为室温或37℃ 1-2小时。但现在对有些标本(如流脑抗原)测定时,仅用37℃ 5分钟。对单克隆抗体检测也可缩短作用时间。


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