我要啦免费统计
400-0066-400

2016-11-22ELISA实验技巧:酶标板分类与性能判断

酶标板作为ELISA检测实验中的辅材,起着举足轻重的作用并直接影响最终实验结果,酶标板的好坏主要取决于其对蛋白吸附的灵敏度、板孔间蛋白吸附能力差异以及所采购酶标板批次间的差异。因此,选择一款蛋白吸附灵敏度高、对蛋白吸附能力孔间差异小、批次间差异小的酶标板产品,是实验者获得可靠、稳定实验结果的保障。
酶标板
酶标板分类:根据不同的分类标准,酶标板有着不同的分类。

一、根据孔数,可分为96孔、48孔等,由于酶标板主要是配合酶标仪用,目前市面上的酶标仪最多为96孔,因此酶标板最为常用的也是96孔。

二、根据其底部的不同,又分为平底的,U型底、V型底等。平底的折射率低,适于在酶标仪检测;U型底的酶标板折射率较高,方便加样、吸样、混匀等操作,可以不用放在酶标仪上,直接通过目测观察颜色变化情况,从而判定有无相应的免疫反应。V底的酶标板可以精确的吸取样品。

三、根据酶标板与蛋白和其它分子结合能力的不同,又分为高结合力、中结合力和氨基化等。

1) 高结合力

此种酶标板,表面经处理后,其蛋白结合能力大大增强,可达300~400ng IgG/cm2,主要结合的蛋白分子量>10kD。使用该类酶标板可提高敏感性,并可相对减少包被蛋白的浓度和用量,不足之处为较易产生非特异性反应。抗原或抗体包被后,以非离子去污剂无法有效地封闭未结合蛋白的部位,需使用蛋白作为封闭剂。

(2) 中结合力

此类酶标板经表面疏水键被动与蛋白结合,适合作为分子量>20kD的大分子蛋白的固相载体,其蛋白结合能力为200~300ng IgG/cm2。由于该类酶标板所具有的仅与大分子结合的特性,适用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体,可降低潜在的非特异性交叉反应。该类板可以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液。

(3)氨基化

这种酶标板经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基,其疏水键由亲水键取代。该类酶标板适合作为小分子蛋白的固相载体。使用合适的缓冲液和pH值,其表面可通过离子键与带负电荷的小分子结合。由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污剂的蛋白分子。该类板的缺陷为由于降低了疏水性,一部分蛋白分子无法结合;此外,其表面需有效地封闭。由于亲水和共价的表面特性,使用的封闭液必须能够与非反应性氨基基团和所选择的交联剂中任何功能基团发生作用。

四、根据颜色可分为透明、黑色、白色。

透明的是最常用的,用于最一般的酶联免疫实验。相对于透明的的酶标板,还有用于发光检测用的不透明的酶标板,一般有黑色和白色两种。黑色的酶标板自身会有光吸收,所以它的信号相对于白色酶标板要低很多,因此一般用于检测较强的光,如荧光检测。而白色的酶标板就用于较弱的光检测,常用于一般的化学发光。另外黑色的酶标板还可以消弱非特异反应带来的问题。同时需要注意的是,用一般的酶标板不可以进行发光检测,因为一般从化学发光反应中发射出的光是各向同性,如果用透明的酶标板,光不仅会从垂直方向发散,还会从水平方向发散,使得光极易通过各个孔之间的间隙和孔壁,从而导致各孔的光吸收值受到相邻孔发射光的影响。

酶标板性能判断

良好的酶标板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间性能相近。酶标板由于原料的不同和制作工艺的差别,各种产品的质量差异很大,因此,每一批号的酶标板在使用前须事先检查其性能。

常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体,保温后洗涤,加底物显色,终止酶反应后,分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差,应小于10%。以下以A、B、C三款酶标板为例。
直接法:检测Human IgG在酶标板表面的吸附
直接法:检测Human IgG在酶标板表面的吸附

双抗体夹心法:包被山羊抗人抗体检测阳性血清中抗原
双抗体夹心法:包被山羊抗人抗体检测阳性血清中抗原

酶标板实验数据

由上图可以看出,这三类酶标板中,A类酶标板具有更好的蛋白吸附效果,同时也提高蛋白吸附的灵敏度,能够提供更为可靠的实验数据。

另外,可以询问酶标板的批内差异,以下是某款酶标板的批内差异。

由批内差异数据图可以看出,该酶标板具有很好地批间稳定性,批内变异系数(CV)差异均在5.0%附近,明显低于业内关于临床免疫反应用酶标板的质量控制标准中批内变异系数低于10.0%的要求,因此也适合用于ELISA实验。
免费咨询
  • 客服专员1
  • 客服专员2
  • 客服专员3
  • 试剂专员1
  • 试剂专员2
  • 400-0066-400

免责声明: 本站资料及图片来源互联网文章,本网不承担任何由内容信息所引起的争议和法律责任。所有作品版权归原创作者所有,与本站立场无关,如用户分享不慎侵犯了您的权益,请联系我们告知,我们将做删除处理!